Molecular Therapy ( IF=8.402）| 一篇单细胞测序挖掘带你探索癌症免疫抑制和预后差的根源（生信挖掘篇）

当提到单细胞测序，第一反应：太贵，烧钱；再提到公共数据库，不好发文章。在此，大师姐要跟大家说，其实公共数据的挖掘不仅是寻找科研思路的重要手段也能发高分。其实在科研道路上不缺乏数据，最缺乏的是ideal。不信大家来看看，人家是如何通过公共数据库中的数据完美演绎出影响因子高达8.402分的文章。

1. 引言

在这篇文章中作者主要通过单细胞测序数据揭示肾透明细胞癌（ccRCC）中瘤内异质性导致的肿瘤预后差及免疫抑制的根本原因。文中不仅揭示了巨噬细胞M2极化是导致肿瘤免疫抑制和预后差的主要原因，还重点解释了CD8+T细胞耗竭也是肿瘤恶化和进展的主要因素。现在来看看文章的整体思路：

2. 数据来源

(1) 单细胞测序数据：来自3个病例的21个样本（12个肿瘤样本和9个对照样本）

(2) TCGA数据库中的肾透明细胞癌（TCGA_KIRC）,包含533例肿瘤样本和72例正常样本

3. 结果展示

1）单细胞测序数据的质控和细胞群分类

作者通过对单细胞测序数据进行质控后，获得24550个细胞，其中7786个细胞来源于正常组织，16764个细胞来源于肿瘤组织。随后通过cell marker数据库对其进行注释，最后筛选到了15种细胞类型（癌细胞、9种免疫细胞及5种非免疫细胞），为了揭示瘤内异质性，又针对这15类型细胞进一步细分，共分选出39种细胞亚型（21种非免疫细胞簇，18种免疫细胞簇）。

通过对TCGA数据库肾透明细胞癌（TCGA-KIRC）进行差异分析发现，ALDOB，MT1G，GPX3，MIOX基因在正常组织中高表达，在癌组织中基本不表达，由此提出，以上基因的异常表达可能是ccRCC的风险信号。此外还发现，ccRCC具有独特的糖酵解代谢模式。结果如下图所示：

2) 巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境中占重要位置且趋向M2极化

作者为了探讨肿瘤微环境中细胞间的相互作用关系，通过CellphoneDB数据库分析潜在的受体-配体对并构建相互作用网络，结果发现巨噬细胞与其他细胞类型的互作关系对最多，由此说明，巨噬细胞是ccRCC肿瘤微环境中重要的免疫细胞类群。

为了研究瘤内异质性，针对3698个巨噬细胞进一步分类，共分成了4簇细胞群（4类亚型）；经对该类群进行免疫荧光染色验证发现，具有M2极化的标记物（CD68\ CD163\TREM2\TAMs\VEGFA）在cluster1中均高表达（证据1）；scRNA-seq分析发现，TREM2仅在cluster1中存在（证据2）；最后通过TCGA-KIRC测序数据分析TREM2与M2极化标记物之间的相关性，结果发现相关系数均大于0.5（证据3）。由此说明，该细胞簇极有可能为M2极化的巨噬细胞群。

为了揭示cluster1巨噬细胞簇的功能，通过免疫检查点的分析和验证，发现CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）在cluster1中的表达相对较高。据报道，这些分子可以通过与CD8+T细胞表面的受体PD-1结合来抑制CD8+T细胞的活性。由于所有这些免疫抑制配体都能抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能，这一证据证明了cluster1巨噬细胞的免疫抑制特性增强。GSVA分析结果发现cluster1中的基因在补体和干扰素（IFN）通路中显著上调，炎症通路下调。种种的证据说明了，cluster1为M2巨噬细胞类群，且具有促进肾透明细胞癌的发展和恶化。

结论：肿瘤微环境中的巨噬细胞M2极化是肾透明细胞癌预后差和免疫抑制的重要原因。 

3）ccRCC 肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭

揭示完巨噬细胞，作者发现T细胞也是肿瘤微环境中重要的免疫细胞类型，通过将5108个CD8+T细胞分为了四种细胞簇亚型，其中cluster2主要来源于正常组织，而cluster1，cluster3，cluster4来源于肿瘤组织。

随后，作者通过免疫检查点验证分析发现抑制性检查点，包括HAVCR2（TIM3）、LAG3、PDCD1（PD-1）、TIGIT、CD27、CTLA-4和TNFRSF9（T细胞衰竭的标志物），在cluster4细胞簇中上调，这些数据表明cluster4细胞在TME中趋向耗竭。

为了验证这一现象，作者通过组织芯片进行了免疫荧光检测，该基因在CD8+T细胞在肿瘤组织中高度表达。此外，LAG3和HAVCR2在大多数肿瘤浸润CD8+T细胞中高表达（图3D和3E）。目前，PD-1/PD-L1和CTLA-4是最受欢迎的免疫治疗靶点。由于LAG3和HAVCR2在这个耗竭的T细胞亚群中的表达明显高于PD-1，研究表明LAG3和HAVCR2可能是ccRCC免疫治疗的较好靶点。

为了观察T细胞衰竭的过程（时间轨迹），作者通过拟时分析发现，来自正常组织的cluster2 CD8+T细胞倾向于转化为肿瘤浸润性T细胞亚群。此外，在分化轨迹的末端出现了代表耗竭的T细胞簇（cluster4）, 在这个过程中，T细胞衰竭相关的免疫检查点（PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、TNFRSF9、TIGIT）倾向于上调，而增效检查点（CD226、CD7）倾向于下调（图1G）。免疫检查点分析，细胞分化轨迹分析，功能富集分析均说明了CD8+T细胞在ccRCC早期被激活，持续抗原刺激后，活化的CD8+T细胞趋向耗竭，DNA甲基化可能在这一过程中起重要作用。

SCENIC分析发现，转录因子STAT3T及HIVEP、NFAT等调控的基因在耗竭CD8+T细胞中上调表达，这一结果为识别ccRCC特异性T细胞功能障碍的新候选转录因子提供了线索。

结论：CD8+T细胞耗竭与肿瘤进展和预后差息息相关。

4）ccRCC癌细胞代谢异常

作者通过分析癌细胞和肾小管细胞的差异表达基因和功能富集发现，如图4B所示，缺氧反应、免疫抑制、脂质合成在癌细胞中显著富集，脂质分解被抑制，结果与前期研究发现ccRCC组织和细胞系中脂滴的异常聚集相一致。有助于解释在肿瘤微环境中，免疫细胞对肿瘤的免疫抑制作用。PPAR通路的异常变化是ccRCC代谢异常的主要特征。

此外发现，STAT3通路在癌症中上调，STAT3不仅参与巨噬细胞向M2极化还参与T细胞的耗竭，从而说明STAT3抑制可作为治疗ccRCC的一种新的治疗策略。

5)  肌成纤维细胞在ccRCC肿瘤微环境中显著富集且异质化

经分析发现，如图5A所示，大多数成纤维细胞来自肿瘤组织。这些肌纤维母细胞聚集成3亚型（cluster1，PDGFRB+FABP5+CEBPB+；cluster3，NNMT+IL32+COL1A1+；cluster，无标记物）（图5C）。有趣的是，如图5C所示，FABP5几乎只在成纤维细胞中表达。此外，CEBPB还与脂质代谢有关。这些数据显示，异常的脂质代谢不仅可能发生在癌细胞中，也可能发生在肿瘤相关成纤维细胞中。

此外，作者还发现不同内皮细胞亚型具有表现出了不同的功能，肿瘤来源的内皮细胞cluster1和cluster 6，GSVA分析结果揭示两种细胞亚型表现出不同的功能，cluster6高增殖、炎症反应明显及参与ccRCC的免疫抑制浸润；而，cluster1炎症反应受抑制。

6)  肿瘤免疫细胞浸润与ccRCC预后不良相关

首先，作者通过TCGA-KIRC数据库中分析各类细胞亚群的相对丰度，以探讨本研究中检测到的细胞簇的临床价值（图S7A）。如图6A和6B所示，四个细胞簇（癌细胞cluster4、CD8+T cluster4、内皮细胞cluster 6、成纤维细胞cluster 3）与低总生存率（OS）和无病生存率（DFS）相关（p<0.05）。

此外，CD8 T Cell cluster 4和Macroophage cluster1 预后差，及CD8+ T Cell cluster 4在高级别及肿瘤后期中表达丰度高，提示T细胞耗竭与ccRCC进展相关。 

最后，为了进一步研究免疫浸润的临床价值，作者通过consults ClusterPlus30将533例ccRCC患者分为三种不同的免疫亚型（图6E）。与第1组和第3组患者相比，第2组患者的预后明显较差（图6F）。有趣的是，我们注意到CD8+T细胞簇3和4表现出最大的差异，因为CD8+T细胞簇3的比例降低，而CD8+T细胞簇4在簇3患者中富集（图6G和6H）。

结论：这些数据进一步证明了T细胞衰竭在ccRCC进展中的关键作用。因此，阻断参与这一过程的免疫检查站可能成为ccRCC治疗和药物发现的有利靶点。 

7) 总结

（1）从单细胞层面探究了ccRCC肿瘤微环境中细胞的异质性，及重要细胞亚型的预后状况。最终发现，T细胞耗竭是ccRCC免疫抑制特性的关键因素且与不良预后相关，参与肿瘤进展。

（2）鉴定了免疫治疗新靶点。

（3）进一步揭示了T细胞耗竭在ccRCC中的关键作用，阻断该过程靶基因有望成为治疗ccRCC的药物靶点。

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